純種分離

從混雜微生物群體中獲得只含有某一種或某一株微生物的過(guò)程稱(chēng)為微生物分離與純化。在分子生物學(xué)的研究及應(yīng)用中，不僅需要通過(guò)分離純化技術(shù)從混雜的天然微生物群中分離出特定的微生物，而且還必須隨時(shí)注意保持微生物純培養(yǎng)物的“純潔"，防止其他微生物的混入。

純種分離的目的是將目的菌從混雜的微生物中分離出來(lái)，獲得純培養(yǎng)。

如果樣品沒(méi)有經(jīng)增殖培養(yǎng)而直接進(jìn)行分離，那么要得到具有某一特性的純種，就更該細(xì)致、謹(jǐn)慎的操作。

純種分離的常用方法有4種：

傾注平板分離法、涂布平板分離法、平板劃線(xiàn)分離法和組織分離法。

1、傾注平板分離法：培養(yǎng)后，在培養(yǎng)基內(nèi)部及表面形成單菌落。

傾注平板法:將無(wú)自生理鹽水稀釋后的樣品加入無(wú)茵培養(yǎng)基混合均勻。待凝固后倒置培養(yǎng)，內(nèi)部及表面形成單自落。

2、涂布平板分離法：培養(yǎng)后，在培養(yǎng)基表面形成單菌落。

因?yàn)閷⑽⑸飸乙合燃拥捷^燙的培養(yǎng)基中再倒平板易造成某些熱敏感菌的死亡，且采用稀釋倒平板法也會(huì)使一些嚴(yán)格好氧菌因被固定在瓊脂中間缺乏氧氣而影響其生長(zhǎng)，因此在微生物學(xué)研究中常用的純種分離方法是涂布平板法。

用途：一般多用于菌種的純化；

優(yōu)點(diǎn)：可以觀察菌落特征，對(duì)混合菌進(jìn)行分離；

缺點(diǎn)：不能計(jì)數(shù)；

控制每個(gè)平板中微生物的菌落數(shù)在一定的范圍可獲得理想的分離效果，對(duì)于細(xì)菌和酵母，以每平板10~200菌落為佳，對(duì)于絲狀菌，則應(yīng)控制每平板菌落數(shù)30~50或更少。

如果分離菌絲呈蔓延性生長(zhǎng)的絲狀菌如根霉、毛霉等，則可以在培養(yǎng)基中添加0.1%左右的去氧膽酸鈉（去氧膽酸鈉在低PH下滅菌過(guò)程中易形成絮狀沉淀，可以通過(guò)分別滅菌、傾注平板前混合的方法避免）或山梨糖（在察氏培養(yǎng)基中加山梨糖0.1%，蔗糖0.01%），這樣可防止菌絲蔓延，便于挑取。

3、平板劃線(xiàn)分離法：能達(dá)到純種分離的目的。

經(jīng)培養(yǎng)后會(huì)得到呈分散狀態(tài)的單菌落純培養(yǎng)。

最/簡(jiǎn)單的分離微生物的方法是平板劃線(xiàn)法，其原理是將微生物樣品在固體培養(yǎng)基表面多次作“由點(diǎn)到線(xiàn)"稀釋而達(dá)到分離目的的。劃線(xiàn)的方法很多，常見(jiàn)的比較容易出現(xiàn)單個(gè)菌落的劃線(xiàn)方法有斜線(xiàn)法、曲線(xiàn)法、方格法、放射法、四格法等。

用途：一般多用于篩選菌株；用于平板培養(yǎng)基的回收率計(jì)數(shù)。

優(yōu)點(diǎn)：可以計(jì)數(shù)，可以觀察菌落特征。

缺點(diǎn)：吸收量較少，較麻煩，平板不干燥效果不好，容易蔓延。如果菌液密度大的話(huà)，長(zhǎng)不出單菌落。

4、組織分離法：適用于從子實(shí)體或罹病的植株上分離高等真菌或植物致病菌。

分離時(shí)，切取小塊受病組織，用10%漂白粉水或0.1%升/汞液進(jìn)行表面消毒，并用無(wú)菌水洗滌數(shù)次后，移置于培養(yǎng)皿中的瓊脂培養(yǎng)基表面上，在適宜的溫度條件（25℃~26℃）培養(yǎng)。

受病組織內(nèi)潛伏的微生物開(kāi)始生長(zhǎng)，經(jīng)3~5天后，就可以看到從受病組織周?chē)L(zhǎng)出菌絲，并向外擴(kuò)展。

經(jīng)菌落特征的觀察和鏡檢，確認(rèn)是所需分離的菌種時(shí)，即用火焰滅菌的接種針從邊緣挑取少量菌體，移到斜面培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

與增殖培養(yǎng)一樣，在純種分離時(shí)同樣也要根據(jù)實(shí)際情況對(duì)培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分和培養(yǎng)條件進(jìn)行適當(dāng)?shù)目刂疲垣@得良好的分離效果。